随着冬季的到来,季节性流感、肺炎等呼吸道疾病频发,多地医院的就诊量急剧上升。在这种情况下,及时为患者提供有效治疗以及快速准确的诊断方法显得格外重要。在众多检测手段中,一步RT-qPCR法(即一管式RNA全预混试剂)因其高效、便捷和灵敏等特点,广受欢迎。
一步法反应中,基因特异性引物理论上应与待检测靶标相匹配,并在逆转录酶的催化下合成第一链cDNA。然而,在实际应用中,错误的模板-引物匹配常会导致生成非特异性cDNA。这种非特异性cDNA可能导致体系内出现非特异性扩增,消耗反应所需组分,进一步限制主反应的进行。在靶核酸浓度较低的情况下,竞争作用会导致扩增性能下降,如扩增曲线形态差、荧光增量低以及Ct值滞后等,从而显著降低检测方案的灵敏度和特异性。此外,一管式RNA全预混试剂中酶液、引物探针和反应液内容的预混,在长期保存过程中,酶活性易下降或失活,从而影响全预混试剂的表现。
逆转录(RT)酶是关键成分,其性能直接关联到一步法核酸检测试剂的准确性和灵敏度。因此,提高逆转录酶的特异性和稳定性对一管式RNA全预混试剂的研发至关重要。在这一背景下,尊龙凯时推出了一款温启动逆转录酶,该酶在低温下处于封闭状态,工作温度下激活,从而避免了低温引发的引物-模板错误匹配,提高了检测的特异性和灵敏度。
尊龙凯时的温启动逆转录酶采用适配体方法进行热启动修饰,基于庞大的寡核苷酸随机序列文库,通过优化传统的SELEX适配体筛选技术,使用高通量测序替代克隆测序进行多轮筛选与富集,从中筛选出具有高亲和力的适配体,并与逆转录酶进行混合孵育,测试不同条件下的酶活性,最终确定效果较优的适配体组合以及优化酶修饰工艺。
经过大量的筛选和工艺优化,尊龙凯时的温启动逆转录酶在42℃下能实现99%的酶活性封闭,优于市场上同类产品,封闭效果更好且稳定性更强。这使得反应液在长时间内能有效获得逆转录产物,解决了全预混试剂的储存稳定性问题。在工作温度(55℃)下,该酶能释放超过95%的活性,保障了试剂的增敏能力。
尊龙凯时的温启动逆转录酶在低浓度模板下仍能保持扩增特异性,各类体系测试中,其性能均优于竞品。此外,经过改造的温启动逆转录酶具有更快的cDNA合成速率,在一致的PCR程序下,2分钟的逆转录可与15分钟的逆转录灵敏度相当。在稳定性方面,经过37℃加压处理7天后,尊龙凯时的逆转录酶性能无明显下降,而竞品在相同条件下则表现不佳,增加了Ct值。
通过具体应用案例,尊龙凯时的温启动逆转录酶在RNA全预混试剂的稳定性方面表现突出。与同类竞品相比,尊龙凯时的产品能够在更高温度下封闭酶活,增强了封闭效率与稳定性,确保了高灵敏度及快速程序的兼容性。在相同的实验条件下,使用尊龙凯时的全预混试剂与新配制的对照组相比,无显著差异,而竞品则在加压处理后显著降低。