mRNA技术作为一种崭新的生物医药技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为疾病的预防和治疗开辟了全新的思路。然而，mRNA技术的发展并不是毫无挑战，其中最大的困难之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，可能引发机体免疫反应，从而影响mRNA的安全性和有效性。因此，如何有效减少dsRNA的生成，成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统解决方案通常依赖于繁琐的纯化工艺，但这不仅成本高、效率低，还难以彻底清除微量的dsRNA。T7RNA聚合酶（T7RNAP）作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具酶，其天然活性（包括末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的主要因素。因此，通过定向进化或理性设计对T7RNAP进行改造，成为全球科研团队的研究重点。

2024年3月3日，尊龙凯时团队在FEBS Journal发表了一项题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们的团队通过工程化改造T7RNAP，成功显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成（仅为野生型的18%），同时大幅提升了mRNA合成的整体效率和质量，推动了基因治疗与疫苗开发领域的飞跃式发展。

我们的创新性研究结合了定向进化与半理性设计的方法，成功筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现优异。我们构建了随机突变库，并设计了一种能够实时监测液滴内RNA产物完整性及dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终筛选出的关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T）产生的dsRNA含量明显低于野生型。

同时，我们还采用半理性设计的方法，构建了十个单点饱和突变库，通过微孔板筛选技术识别出有益的突变体。经过筛选超过1000个突变体，我们发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）产生的dsRNA含量显著低于野生型，并且未影响转录效率。为进一步优化，我们针对以上突变位点构建了DNA重组库，并通过微孔板筛选最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E），实验表明该突变体的dsRNA含量仅为野生型的18%。

这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，发现最优突变体M11的产物引发的干扰素β（IFN-β）mRNA及蛋白表达量仅为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达的细胞数量显著增加且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA可有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA治疗的潜力。

为了深入了解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性及末端转移酶活性，从而导致dsRNA含量下降。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论支持。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法和思路，同时为mRNA技术发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的形成，提升了mRNA的质量与安全性。凭借此次研究成果，尊龙凯时成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250U/μL)）。这一产品在mRNA疫苗和mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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