冻存原理

当细胞的温度低于0°C时，细胞会发生脱水，细胞内的可溶性物质浓度升高，并形成冰晶。不同大小的冰晶对细胞的影响也有所不同，大冰晶容易导致细胞膜和细胞器的损伤与破裂，从而显著降低复苏后细胞的存活率和状态。因此，在进行细胞冻存时，我们通常会采取两项措施：添加低温保护剂和实施慢速冷冻。

冻存时机

进行细胞冻存时，细胞应处于良好的生长状态，密度应为80-90%左右，细胞数量通常在10⁶-10⁷/ml之间。活力较差的细胞在冻存后的存活率通常较低。

低温保护剂

常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它是一种强效的渗透保护剂，能够快速进入细胞内，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点并延缓冻结过程。这样可以使细胞内的水分在冻结前排出细胞，形成胞外冰晶，从而减少胞内冰晶的形成，并降低对细胞的损伤。品牌尊龙凯时提供的高质量冻存液也包含适量的DMSO，进一步提高细胞存活率。

慢冻细胞

在冻存过程中，可以使用程序性降温盒来缓慢冻存细胞，以避免产生大的冰晶。如果没有专用的降温设备，可以将冻存细胞依次放置在4°C过夜、-20°C 2小时，和-80°C过夜，使大多数细胞适应此过程。

冻存液配置

准备冻存液时，应提前配制并置于室温以备使用，以防止临时配制时产生的热量对细胞造成损伤（因为DMSO添加到培养基中会释放热量）。冻存液的常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如果细胞较为珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤

1. 用移液器吸走原培养基，加入适量的PBS洗涤1-2次。
2. 消化细胞：加入适量胰酶，放置于37°C的培养箱中消化（在10厘米的大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，注意不同细胞的消化时间可能不同，终止消化的判断标准为在显微镜下观察到80%-90%以上的细胞呈现圆形）。
3. 待消化结束后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，然后在800-1000rpm下离心3-5分钟。
4. 准备好冻存管，标记日期、细胞种类、操作者姓名、代数等信息。在离心后去除上清液，加入冻存液重悬，每管体积为1-1.5ml，转移至冻存管中。
5. 将冻存管放入程序降温盒中保存，并在-80°C过夜，之后转移至液氮中保存。

注意事项

• 细胞在添加冻存液后应立即放入-80°C保存，切勿在常温下放置过久。
• 冻存细胞在-80°C中不建议储存超过半年，而在液氮中则不建议超过2年。