一、RNA模板的制备

在生物医学研究中，RNA模板的提取是关键步骤。常见的RNA提取方法包括传统的酚-氯仿提取法和柱式提取法。

操作流程概要——以Vazyme产品RNAisolater Total RNA Extraction Reagent （Vazyme#R401）为例：

1. 材料准备：需准备CHCl₃、异丙醇、75%乙醇（利用DEPC水配制）及DEPC水。

2. 样本制备：需要控制样本量，过多会导致裂解不充分，降低产物纯度。以下为适宜的最大样本量：

• 贴壁细胞：弃去培养液后，用PBS清洗一次。
• 对于每10cm²培养面积的细胞，加入1-3ml RNAisolater，使其覆盖细胞表面，并使用移液器轻轻吹打，确保细胞充分裂解。
• 转移裂解液至15ml离心管中，重复吹打至无明显颗粒，冰上静置5分钟。

3. 悬浮细胞处理：

• 离心收集细胞并用PBS洗涤一次。
• 每5×10⁶-10⁷个细胞加入1ml RNAisolater，反复吹打至无明显颗粒，冰上静置5分钟。

4. 动物组织处理：液氮研磨应彻底，以保证RNA的提取效率：

• 液氮研磨的粉末应立即转移至离心管中，加入RNAisolater裂解液，静置至融化后，继续吹打直至透明。
• 将裂解液转移至离心管，进行12,000×g 4℃离心5分钟，吸取上清液。

5. 匀浆处理：为了更有效地提取RNA，可将新鲜组织剪碎，浸泡在RNAisolater中，使用电动匀浆器充分匀浆，确保组织均匀。

提取流程——柱式抽提法以尊龙凯时的FastPureTM Cell/Tissue Total RNA Isolation Mini Kit（Vazyme#RC101/RC111）为例：

1. 材料准备：准备β-巯基乙醇、无水乙醇及RNase-free枪头等。

2. 细胞处理：

• 贴壁细胞：可直接使用加入β-巯基乙醇的Buffer RL1进行裂解；或用胰酶消化，离心收集细胞后加入Buffer RL1，每2-5×10⁶个细胞添加500μl Buffer RL1，混匀直至无细胞团块。
• 悬浮细胞：直接离心收集，加入Buffer RL1，每2-5×10⁶个细胞添加500μl，混匀后如不立即进行下一步，可置于-70℃保存。

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